Soru:
MinION sıralama çalıştırmalarının verimini nasıl artırabilirim?
gringer
2017-05-31 14:48:19 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Bu, nanogözenek topluluğu içinde sık sorulan bir sorudur. Oxford Nanopore şu anda 10-15 gigabazlık çalıştırma verimi üretebildiklerini iddia ediyor (ör. buraya ve buraya bakın), ancak yine de kullanıcıların yalnızca 1-5 gigabaz aralığı.

Öyleyse verimde neden büyük fark var?

üç yanıtlar:
#1
+12
gringer
2017-05-31 15:02:35 UTC
view on stackexchange narkive permalink

PoreCampAU 2017'de Josh Quick'in hem iyi sıralama verimi hem de uzun okuma uzunluğu elde etmenin önündeki bazı ortak engelleri tartıştığı bir konuşmaya katıldım. Çoğunlukla numune hazırlama konusunda daha dikkatli olmaya kadar kaynar. MinION'un yine de kirli bir numuneyi sıralayacağını unutmayın, sadece düşük verimde olacaktır. İşte o konuşmadan aldığım notlar:

  • MinION dizileme ile ilgili en zor şey örneği ilk etapta almaktır
  • Çok sayıda farklı örnek türü ve ekstraksiyon yöntemi vardır
  • Yazdıklarınızdan daha uzun okuma alamazsınız; içeri sızmak bokun çıkmasına neden olur
  • DNA hareket etmediğinde çok kararlıdır, ancak yanal hasara karşı çok hassastır
  • DNA ekstraksiyonunun fenol kloroform yöntemi çok iyidir ve ekstraksiyonu kolaylaştırmak için faz kilitli bir jel
  • Basit bir tuz + alkol ekstraksiyonu ekstraksiyon için en iyi yöntem olabilir (çünkü DNA üzerinde en az miktarda çalışmayı içerir)
  • EDTA (örneğin, TE tamponunda bulunduğu ve birçok ekstraksiyon kitinde olduğu gibi) hızlı kit ile uyumlu değildir
  • Josh'un laboratuvarı tarafından üretilen tutarlı ve en iyi Nanopore çalışmaları, R9.4'te 1D ligasyon çalışmaları; en iyi genel çalışma fenol-kloroform ekstraksiyonu + hızlı kitti
  • John Tyson düşük verimli bir delikten (yazılım yoluyla) kendini ayarlayabilir
  • Az sayıda kısa okuma çok önemli
  • Önerilen (ve çoğunlukla denenmemiş) saflaştırma teknikleri: döndürme kolonu (60-100kb); etanol ekstraksiyonu (100-150kb), diyaliz (150-250kb); düşük erime noktalı agaroz tıkacı (~ 1Mb, yerinde DNA ekstraksiyonu)
  • Nanogözenek protokol girişi nanogram cinsindendir, ancak gerçekten molarite olarak belirtilmelidir; kit yaklaşık 0,2 pmol girdisi bekliyor
  • Membran yüzeyine bağlı resim molekülleri. Ardından, akış hücresi yoğunluğunun sıra uzunluğundan bağımsız olduğunu görebilirsiniz
  • Tapestation, Qubit ve Nanodrop hepsi iyi bir fikirdir; üç testi de geçebilen bir DNA örneği işe yarayacaktır: Tapestation ile kısa uzunlukta omuz yok, Qubit tarafından yeterli DNA, Nanodrop ile yüksek saflık
  • RNA dizilemeye müdahale edebilir; RNA'yı sindirmek önerilir
  • DNA'yı dondurmak gerçekten kötü bir fikirdir. Buz kristalleri DNA'yı küçük parçalara ayırmada çok iyidir
  • Buzdolabında saklanan DNA dikkate değer ölçüde stabildir; iki yıldan fazla (ve muhtemelen sonsuza kadar) saklanabilir

Verimle ilgili güncelleme:

Haziran 2018'de PCR'den yaklaşık 3 milyon okuma alan bir deneme yaptık. büyütülmüş fare cDNA'sı (~ 1 kb'lik N50'yi okuyun) ve bu, biri tarafından hazırlanan ilk örnek olduğu bir durumdu, giriş DNA miktarı olması gerekenin yaklaşık% 20'si kadardı ve bir dataloss olayına maruz kaldık . Kötü bir koşuda böyle olduysa, gelecekteki koşularımız için büyük umutlarım var.

Ağustos 2018'deki bir sonraki cDNA çalışmamız yaklaşık 7 milyon okuma ve benzer bir N50 okuma üretti (yani toplam verim yaklaşık 7 Gb). Çalıştırma, ilk gece bir Windows güncellemesiyle kesintiye uğradı (daha önce otomatik güncellemeleri devre dışı bırakmıştım, ancak bunlar yeniden etkinleştirildi) ve o zamandan beri sıralama verimini artırmak için ek yazılım ve donanım güncellemeleri yapıldı. İyi bir akış hücreniz ve benzer bir örnek hazırlığımız varsa, yapacağımız bir sonraki cDNA çalışmasının 8 milyondan fazla ve muhtemelen 10 milyondan fazla okuma üretmesini bekliyorum.

#2
+2
roblanf
2017-06-10 08:52:26 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Bahse girerim, nanogözenekliler (elbette!) iki önemli konuda bir ton optimizasyon yapmışlardır:

  1. DNA temizleme
  2. Kütüphane hazırlıkları

Çoğu DNA ekstraksiyonu için temizliklerin çok farklı olabileceğini düşünüyorum, ancak Blue Pippin gibi bir şey, birine erişiminiz varsa ve onu kullanabilirseniz olağanüstü bir iş çıkaracaktır (işe yaramayacaktır elbette bir jelde hareket edemeyen SÜPER uzun DNA parçaları için). Blue Pippin ayrıca boyut seçiminizi de yapar, böylece çok sayıda küçük şeyi sıralayan gözenekleri yakmazsınız. Bu da verim sağlamaya yardımcı olacaktır.

O zaman her şey kitaplık hazırlığına bağlıdır ve @ gringer'ın cevabında bununla ilgili bazı iyi ipuçları var.

#3
+1
Saidi Rahina Hussain
2018-10-27 01:28:34 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Bir mantarla çalışıyorum ve DNA ekstraksiyonu için CTAB yöntemini kullanıyorum ve ilk kitaplık hazırlığım için hızlı kit kullandım ama işe yaramadı ve o zamandan beri ligasyon kiti kullanıyorum ve bu bana çok iyi sonuçlar veriyor . 4 GB ile 13 GB arasında değişen verileri almayı başardım.



Bu Soru-Cevap, otomatik olarak İngilizce dilinden çevrilmiştir.Orijinal içerik, dağıtıldığı cc by-sa 3.0 lisansı için teşekkür ettiğimiz stackexchange'ta mevcuttur.
Loading...